时间：2021-09-30 11:43:50 所属分类：临床医学 浏览量:
创伤、畸形、感染和癌症切除术引起的骨缺损，既严重影响了患者的生理和心理健康，也给社会经济造成沉重负担[1]。然而，自体移植和同种异体移植等传统治疗方法由于免疫排斥、术后感染、流行病传播风险等原因，在临床实践中应用受限[2]。骨组织工程是一种利用
创伤、畸形、感染和癌症切除术引起的骨缺损，既严重影响了患者的生理和心理健康，也给社会经济造成沉重负担[1]。然而，自体移植和同种异体移植等传统治疗方法由于免疫排斥、术后感染、流行病传播风险等原因，在临床实践中应用受限[2]。骨组织工程是一种利用支架植入细胞或加入生物活性生长因子促进骨修复和再生的新方法，为再生医学提了供一个创新的平台[3]。骨组织工程中使用的支架旨在提供结构支持，为细胞黏附、迁移、增殖和分化创造合适的环境，并重塑骨缺损部位的功能活性[4]。为满足生物医用需求，新的、更满足应用需求的支架材料被不断开发。
水凝胶是一类具有高含水量的高分子3D交联材料[5]，由于具有较好的生物相容性、机械强度和易获得性，已被广泛应用于细胞培养[6]、药物递送[7]、组织工程等生物医用领域[8]。然而在使用过程中，水凝胶易受到外部物理或化学损害而导致自身结构或功能完整性的破坏[9]，因此传统水凝胶的结构和功能不可逆性限制了其广泛应用。自修复水凝胶是指通过动态链接形成的水凝胶体系，在破坏后可自发修复，完成结构和功能的恢复[10]。得益于其独特的自修复性能，自修复水凝胶近年来受到科研人员的广泛关注，并被应用于多种新型智能材料的研发。
由于具有良好的自修复性，自修复水凝胶已被广泛应用于骨组织工程[11,12,13,14,15,16,17,18,19]。该文将系统介绍自修复水凝胶的凝胶化机制和组成成分，总结其在骨组织工程中的应用，并探讨目前存在的问题及未来的发展方向。
1 资料和方法Data and methods
1.1 资料来源
应用计算机对中国知网、万方、维普、Pub Med、Embase和Web of Science数据库2000-2020年发表的文献进行检索，中文检索关键词为“自修复水凝胶，骨组织工程，骨再生”，英文检索关键词为“self-healing hydrogels;bone tissue engineering;bone regeneration”。
1.2 入选标准
纳入标准：(1)有关自修复水凝胶的凝胶化机制、组成成分的文献;(2)有关自修复水凝胶在骨组织工程中应用的文献;(3)此领域中观点、论据可靠的文献。
排除标准：(1)与研究目的无关的文献;(2)重复性研究;(3)内容陈旧或可信度较低的文献;(4)无法获取完整资料的部分文献。
1.3 数据的提取
共检索到文献318篇，其中中文文献78篇，英文文献240篇，排除与研究内容相关性低、内容陈旧及重复的文献249篇，共纳入69篇符合标准的文献进行综述，见图1。
2 结果Results
2.1 自修复水凝胶的凝胶化机制
由于传统水凝胶的共价键在解离后难以重建，因此微小裂缝不断积累极易导致水凝胶断裂。许多天然组织如骨骼、软骨、皮肤等，都具有在轻微损伤后自修复的特性，这使其能够承受多次损伤，维持生物学功能。受这一自然现象的启发，赋予人工水凝胶自修复特性是研发智能水凝胶的一大步。下文将分别讨论基于动态共价键、超分子键和多机制交联的自修复水凝胶的凝胶化机制。
2.1.1 动态共价键
与常规共价键不同的是，动态共价键处于可逆状态，具体来说，平衡的正向或逆向移动可使共价键在较温和的条件下经历形成、破坏或重新形成的状态。理论上，平衡的动态性主要由平衡常数决定，一般情况下，平衡常数在10-7-107范围内表示反应具有可逆性，大于107或小于10-7则表示不可逆[20]。与超分子键相比，动态共价键键能较高、更稳定，因此动态共价键既能赋予水凝胶常规共价键的稳定性，又能赋予其超分子键的可逆性，呈现出“自修复”的特性。希夫碱键(包括亚胺、腙和肟)是指分别由醛与伯胺、酰肼和氨基经缩合反应形成的化学键[21]。JIANG等[22]利用壳聚糖盐酸盐和氧化葡聚糖制备了一种具有良好自修复能力的水凝胶，壳聚糖盐酸盐的氨基和氧化葡聚糖的醛基之间通过轻微的席夫碱反应形成亚胺键，使水凝胶在中性条件下具有自愈能力;该水凝胶被切割成两半后，室温下30 min内可以修复为一个整体。此外，由于自身特殊的化学结构，希夫碱键表现出p H值响应性，即与生理微环境相比，酸性微环境中水凝胶的降解速率更高、内部孔隙更大，提高了药物释放速率。
除了希夫碱键外，许多具有类似“动态”特性的共价键也可用于制备自修复水凝胶，比如狄尔斯-阿尔德反应[23]、硼酸酯化学键[24]、二硫键[25]、克诺维纳盖尔缩合反应等[26]。
2.1.2 超分子键
非共价键主要来自于分子之间的弱连接，因此也被称为超分子键。超分子键可以在解离后迅速重建，使系统具有“自修复”性质[20]。当大环的宿主部分插入到客体部分中时，就会发生主-客体相互作用，形成独特的包含结构[27]。HIGHLEY等[28]报道了一种由主-客体相互作用交联的自修复水凝胶，这种超分子水凝胶以透明质酸为基础，经金刚烷或β-环糊精(金刚烷-透明质酸和β-环糊精-透明质酸)修饰，并且在金刚烷-透明质酸和β-环糊精-透明质酸通过分子间主客-宿主键(金刚烷和β-环糊精部分之间)混合后迅速形成超分子组合;金刚烷和β-环糊精之间的主-客体相互作用可以在解离后迅速重建，使水凝胶具有良好的自修复性，是理想的3D打印材料。此外，该超分子水凝胶的性质可以通过调节水凝胶中的物质浓度以及最终凝胶中客体与主体部分的比例来改变。
除了主-客体相互作用之外，还有许多超分子键，比如氢键[29]、疏水相互作用[30]、离子键[31]、金属配位键和π-π共轭堆积等[32,33]，都已成功地被运用于自修复水凝胶的设计和制备。
2.1.3 多机制交联
虽然近年来自修复水凝胶的研发取得了较大进展，但是仅具备单一动态键的水凝胶仍然有局限性，比如：尽管大多数超分子键都能在温和的条件下迅速结合，但是由于其键能较弱，单一超分子键很难赋予水凝胶理想的机械强度;动态共价键键能一般比超分子键强，但其中很多不能在生理条件下发生(如希夫碱或硼酯键)或需要很长时间来形成或重建(如狄尔斯-阿尔德反应)[10]。运用多个动态键或者联合运用动态键和共价键是改善水凝胶性能最常用的方法[23,30,31]。WANG等[34]通过在同一体系中加入主-客体相互作用和共价键，研制出了具有高机械强度(杨氏模量可达9.13 MPa)和高抗疲劳/抗切片性能的自修复水凝胶，其一是主体(丙烯酸异氰酸根合乙酯改性的β-环糊精)和客体[2-(2-(2-(2-(金刚烷基-1-氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇丙烯酸酯]之间的主-客体相互作用形成“三臂”主客体超分子;其二是主客体超分子之间的共价键合(通过紫外线引发的聚合反应)，从而在水凝胶中形成牢固的交联键。主-客体相互作用提供了一种能量耗散机制来缓冲受力，从而延缓或避免断裂，使水凝胶具有快速自修复的特性;共价键易由UV引发聚合，可以将水凝胶互连成一个强大的网络，使其坚固。
2.2 自修复水凝胶的组成成分
自修复水凝胶的成分会影响其力学性能和生物学性能，例如：天然聚合物通常具有更强的生物相容性;而合成聚合物通常以降低生物亲和性为代价生成更强、更有弹性的水凝胶;将纳米复合材料加入到自修复水凝胶中可赋予该体系独特的性能[35]。该文将根据自修复水凝胶的主要成分将其分为三类——天然水凝胶、合成水凝胶和纳米复合水凝胶，并进一步讨论不同成分的自修复水凝胶的特点。
天然聚合物如藻脘酸盐[36]、胶原[37]、明胶[38]、透明质酸[39]，由于具有易获得和廉价的优点已被广泛用于研发水凝胶[10]。与合成水凝胶相比，天然自修复水凝胶与天然细胞外基质有更大的相似性，可赋予水凝胶较好的生物相容性、生物降解性及一些特殊性能。WU等[40]研发的抗坏血碱-铜离子交联体系具有生物安全性，保证了水凝胶的生物相容性。GA?ANIN等[15]开发了一种通过DNA杂交交联的蛋白质-DNA混合水凝胶，通过DNA上的配体将所需的生物活性分子组装成蛋白质-DNA杂化水凝胶，避免了使用活性有机试剂或催化剂，提高了水凝胶生物相容性。同时，利用DNA酶可以实现从复合凝胶中释放时空可控的生物活性因子。然而，由于天然水凝胶在机械强度和稳定性方面性能不佳，其应用受到了限制。
由于具有化学惰性、强弹性模量、灵活性并易于定制修改，合成聚合物也是研发自修复水凝胶的一种选择。YU等[18]用香豆素衍生物合成了聚丙烯酰胺基水凝胶，研究人员对合成的水凝胶进行了光二聚和光裂解反应，由于香豆素分子内[2+2]光环加成反应，该水凝胶在365 nm紫外线照射下显示出非凡的自愈能力，同时聚丙烯酰胺交联剂的存在显着增强了水凝胶的细胞附着性能。然而，与天然水凝胶相比，合成水凝胶的生物相容性、生物降解性较差。
纳米复合水凝胶是指通过动态键将水凝胶网络和纳米材料增强物连接在一起的水凝胶。将纳米材料引入自修复水凝胶有两个基本目标，一是增强水凝胶的物理性能，如机械强度、流变性能、膨胀度等。MU等[41]将自体富血小板纤维蛋白与明胶纳米颗粒结合研制出双网络水凝胶，研究显示此两组分之间的亲合力(如静电和疏水相互作用)非常高，促进了双网络的形成。理论上，复合凝胶中的自体富血小板纤维蛋白网络通过初级共价网络提供了维持水凝胶完整性的基础，而明胶纳米颗粒形成的次级胶体网络则通过牺牲键来耗散能量，维持自身结构和功能的完整性。二是赋予水凝胶优越的生物特性，例如SHALUMON等[42]开发了凝胶基水凝胶，并研究了纳米羟基磷灰石对支架性能的影响。与大粒径的羟基磷灰石颗粒相比，纳米羟基磷灰石能增强细胞与材料之间的相互作用，提高材料的生物活性[43]。同时，纳米羟基磷灰石可改善蛋白黏附、细胞黏附和增殖[44]。
2.3 自修复水凝胶在骨组织工程中的应用
2.3.1 骨组织工程基础
骨是一种坚硬致密的组织，支撑着全身的肌肉、韧带、腺体、皮肤层和皮下结构[45]。骨组织具有一定程度的自修复能力，可以在小的骨折后自然愈合[46]。了解骨组织的结构和自然愈合过程，可以为正确修复骨缺损提供指导。宏观来看，骨组织结构主要包括皮质骨和松质骨;微观上讲，骨组织中含有机质、无机物和骨相关细胞。骨损伤的愈合可分为5个相互重叠的阶段[47]，一是炎症反应阶段，骨折后短时间内血液在骨折端和周围凝固形成血肿，招募多种炎症细胞并以特定的顺序分泌不同的生物分子，启动修复级联反应;二是血管重建和血管生成阶段;三是软骨痂形成阶段;四是软骨痂矿化和再吸收阶段;五是骨重塑阶段，该过程在损伤后的三四周开始，并可持续数年。
近年来，天然/合成聚合物在骨再生领域引起了广泛关注。水凝胶可以提供自然亲水的三维环境，有利于细胞存活，在修复骨缺损方面有很大的潜力。在研发骨组织工程应用的水凝胶过程中，有以下几个方面因素需要考虑。
首先，从自修复性的角度考虑，研发生物应用的水凝胶需要考虑2个因素。一是水凝胶的自修复动力学，包括修复时间和效率。理想的自修复水凝胶能在损伤后短时间内完全恢复。HUANG等[48]利用端苯甲醛四臂聚乙二醇的醛基与羧甲基壳聚糖主链上的胺基之间的希夫碱键，研发了一种快速自修复水凝胶。自修复实验表明，室温下5 min内，在没有外界干预的情况下被分为两半的水凝胶可在分界处形成一个完整的水凝胶膜;梁形应变压缩实验表明，该水凝胶在生理温度下12 h后自修复率为(94.0±9.8)%。二是水凝胶的自修复条件。部分动态交联只有在特定的条件下(如一定的p H值、温度或特定的介质存在时)才表现出可逆性，例如希夫碱键在酸性环境中不稳定。DING等[49]的研究表明，由丙烯酰胺修饰的几丁质和海藻酸二醛之间的希夫碱键连接形成的水凝胶，只能在碱性或中性环境下自修复。
从骨组织工程应用的角度考虑，水凝胶需要满足特定的物理和生化要求。在物理方面，水凝胶的物理性质(如机械强度、孔径大小和形态)会影响骨修复的最终效果。第一，细胞可以感知水凝胶的硬度并改变自身形态、体积和谱系承受力[50];同时，一些骨组织有承重需求，需要具有一定的韧性[46]，因此在设计骨再生水凝胶时需要考虑合适的机械强度。第二，水凝胶的孔径大小影响细胞的生物行为。有报道称，孔径大于300?m的水凝胶在骨再生方面具有优势，孔径小于100?m的水凝胶对骨再生可能存在不利影响[51]。第三，水凝胶的整体和表面形态也会影响细胞的生物行为。许多研究报道了具有非纤维状形态的水凝胶对特定蛋白质的吸附增强，可能有利于细胞黏附，从而提高促进成骨的潜力[52]。亦有研究表明，利用纳米涂层、喷砂、酸蚀刻、激光蚀刻和等离子体处理等方法改变材料的表面形貌，可以极大地提高细胞的增殖、黏附和谱系定向，从而加速骨再生过程[53]。在生物化学方面，用于骨再生最佳的水凝胶需要满足以下要求：(1)非细胞毒性和非免疫原性：避免对细胞造成损伤或慢性炎症;(2)可生物降解能力：酶或水解引起的水凝胶降解应与新骨长入同步，并最终被新形成的骨组织所取代;(3)骨诱导、骨传导、成骨和骨相容性：增强骨再生。
2.3.2 自修复水凝胶在骨组织工程中的作用方式
自修复水凝胶可以通过不同的方式促进骨再生，现有的研究主要分为两个方向，见图2。
其一，含细胞水凝胶可直接作为干细胞的载体促进骨再生;其二，无细胞水凝胶可通过生物活性药物传递或支架生物功能化来促进细胞动员和细胞活性，进而促进骨再生。该节将分别讨论自修复水凝胶在骨再生中干细胞递送和支架修饰的两种作用方式。
(1)干细胞递送：如上所述，骨再生过程主要依赖于充足的细胞数量、调控生长因子的释放、维持稳定的支架及刺激血管生成[54]。骨髓间充质干细胞具有自我更新、分化潜能、易获得和免疫调节等特性，因此干细胞递送疗法已在骨再生中被广泛应用。干细胞递送主要是将特异性干细胞移植到损伤部位促进愈合[55]，一方面，移植入体内的干细胞可以在体内分化为目标组织(如骨组织)细胞，促进损伤部位的组织再生和修复;另一方面，这些干细胞在体内可以稳定地分泌相关生长因子，并且生长因子的功效随着干细胞的增殖和分化而增强[56]。然而，由于病变区域内的不良环境及干细胞移植后有限的余量和生物活性，干细胞直接注入是不可行的[57]，因此具有出色生物相容性和生物功能性的水凝胶被认为是干细胞递送入体的良好载体[6]。水凝胶不仅为干细胞附着提供了良好支架，在递送过程中保存细胞活性，而且可促进干细胞的增殖和分化，更好地保证了干细胞疗效[58]。
MU等[41]合成了一种多功能地塞米松-脲基嘧啶酮聚合物，结果显示，包裹在水凝胶中的软骨细胞和骨髓干细胞在培养2周后均保持了较高的生存能力，这表明该聚合物具有良好的细胞相容性，可作为细胞递送系统促进骨组织工程。在细胞治疗中，自修复水凝胶比常规水凝胶在用作细胞递送载体方面具有更好的表现，例如：自修复水凝胶的剪切稀变性可以保护封装细胞在注射入体过程中免受剪切力的损害，同时更高效地完成营养/废物交换，为细胞的增殖分化提供更良好的环境[59]。亦有报道显示，自修复水凝胶封装的干细胞具有更高的迁移率与长期生存能力，但具体原因尚不清楚[60]。
(2)支架修饰：上述干细胞治疗方法虽已有运用，但仍具有一定局限性，如有限的自体细胞、时间/成本高的细胞扩张程序、相对较低的细胞存活率和免疫排斥的高风险。利用可募集和激活体内内源性细胞的无细胞水凝胶，可以解决这些问题[61]。该节将分别讨论无细胞自修复水凝胶在活性因子(生长因子、无机离子、小分子药物)递送和支架生物功能化方面促进骨再生的潜力。
活性因子递送：活性因子如生长因子、无机离子和小分子药物，可通过募集或/及激活内源性细胞来实现无细胞水凝胶促进骨再生。然而，活性因子直接导入缺损区是不可行的，首先，骨愈合所需活性物质的量常高于生理剂量，而生理环境对活性物质的量有严格要求，直接注入易造成严重不良反应，例如局部Mg2+水平过高可能导致骨丢失[62];其次，部分活性物质可扩散到其他部位或被酶分解，导致局部残留量有限，不能满足骨再生的需求;同时，活性物质的扩散可出现外周不良反应，例如生长因子扩散可导致囊肿样骨形成和明显的软组织肿胀[63]。利用自修复水凝胶作为递送系统并完成各种活性物质的缓释，是解决上述问题的一种方法。与常规水凝胶相比，剪切稀变性和可注射性使得自修复水凝胶更容易注入到特定区域，侵入量最小。
生长因子在骨形成过程中发挥重要作用，如骨形成间充质干细胞的募集、增殖和分化[64]。最近，许多研究表明引入骨形态发生蛋白[12]、基质细胞源性因子1a[65]、成纤维细胞生长因子[66]、注射富血小板纤维蛋白和转化生长因子β的自修复水凝胶在骨再生中均有显着作用[41,67]。PHIPPS等[12]利用自修复多肽水凝胶RADA-16作为骨形态发生蛋白2的药物递送载体，通过水凝胶中释放的骨形态发生蛋白2上清液处理猪骨髓基质细胞，证明了从RADA-16中释放的骨形态发生蛋白2保持了其原有的生物活性并刺激了骨髓间充质干细胞的生长。
3 讨论Discussion
3.1 既往他人在该领域研究的贡献和存在的问题
该文主要回顾了自修复水凝胶的制备基础及其在骨组织工程中的应用。现研究表明，通过动态共价键、超分子键及多种机制的可逆交联，此类水凝胶具有了自修复的特性，即在因外界理化因素导致自身结构破坏后可自发进行修复，最终完成结构和功能的恢复。根据自修复水凝胶的组成成分可以将其分为天然水凝胶、合成水凝胶和纳米复合水凝胶。虽然近年来自修复水凝胶的研发取得了较大进展，但是仅具备单一动态键的水凝胶仍然有局限性，如何使水凝胶在提高自修复效率的同时兼具良好的机械强度，是未来研发新型智能水凝胶时需值得思考的问题。同时在研发过程中改变水凝胶的组成成分及相关比例，也是赋予水凝胶更多生物学性能的途径。
在骨组织工程应用方面，作者根据支架是否包含细胞而分为了干细胞递送和支架修饰两种作用方式来论述。许多研究显示自修复水凝胶在干细胞递送、活性因子释放时显示出较普通水凝胶的优越性，但机制不明。同时，目前相关研究主要关注干细胞疗法及活性因子递送等治疗方式的短期治疗效果，这些治疗方式是否会导致异常增生、诱发肿瘤等不良反应仍需长期跟踪观察报道。
3.2 该综述区别于他人他篇的特点
作者系统地回顾了自修复水凝胶的凝胶化机制和组成成分，介绍了自修复水凝胶的制备基础，为读者更好地理解自修复水凝胶的性质提供了理论依据。因动态链接原理，自修复水凝胶较传统水凝胶具有更为优越的综合性能，具体表现为：在受到理化或生物因素所致的交联破坏后，自修复水凝胶可自发修复，完成结构和功能的恢复，避免了水凝胶在生物医学领域应用过程中的功能丧失、微生物感染和细胞因子扩散导致不良反应等后果。
之后，结合骨组织生物学基础，作者论述了自修复水凝胶在骨组织工程中的应用，根据支架是否包含细胞，作者创新地将自修复水凝胶作为支架的作用方式分为了干细胞递送和支架修饰两种;在支架修饰方面，作者又根据有无活性因子将其分为了活性因子释放和支架生物功能化两种。此种分类方式突出了不同作用方式的本质差别，便于更好地阐述不同作用原理和作用效果，进而比较不同作用方式的特点并进行总结评价。
作者还探讨了目前存在的问题及未来的发展方向。作者指出未来研发新型自修复水凝胶时，应从制备基础上思考如何使水凝胶在提高自修复效率的同时兼具良好的机械强度。同时作者表示，虽然自修复水凝胶不同作用方式具有不同的机制，但水凝胶支架的使用都是为骨再生提供结构支持，并通过促进细胞黏附、迁移、增殖和分化来促进骨再生，从而重塑骨缺损部位的结构和功能活性。在共性之中，研究各种作用方式的优缺点并提高促进骨再生的效率和效果，是自修复水凝胶在骨组织工程发展中面临的重要挑战。目前自修复水凝胶较传统水凝胶在骨组织工程应用中表现出优越性的机制尚不明确，相关疗法也缺乏长期的跟踪观察报道，更多的研究可以探索相关问题。
3.3 该综述的局限性
由于此综述重在论述自修复水凝胶在骨组织工程中的应用，因此文中对于自修复水凝胶的制备基础仅进行了系统总结。同时，鉴于领域内自修复水凝胶与传统水凝胶在生物应用方面的性能比较和相应机制的报道不足，此次综述在该问题上的总结阐述的理论依据有限。
参考文献
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[2] HAYASHI K,OCHIAI-SHINO H,SHIGA T,et al.Transplantation of humaninduced pluripotent stem cells carried by self-assembling peptide nanofiber hydrogel improves bone regeneration in rat calvarial bone defects .BDJOpen .2016;2:15007.
《自修复水凝胶在骨组织工程中的应用》来源：《中国组织工程研究》，作者：付正; 李润泽; 罗皓天; 陈珺; 王伟财
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