时间：2021-10-15 09:57:53 所属分类：临床医学 浏览量:
微流控芯片是20世纪90年代由Manz等[1]提出，是指通过微加工技术在数平方厘米大小的芯片上集合培养室、通道、微泵等尺寸为微米级的功能元件构成具有微流体控制的分析系统。经过数十年的发展，微流控芯片分析成为当前的科技前沿领域之一。微流控芯片技术将采样
微流控芯片是20世纪90年代由Manz等[1]提出，是指通过微加工技术在数平方厘米大小的芯片上集合培养室、通道、微泵等尺寸为微米级的功能元件构成具有微流体控制的分析系统。经过数十年的发展，微流控芯片分析成为当前的科技前沿领域之一。微流控芯片技术将采样、反应、分离、检测等功能集成在排列有微通道的芯片上，主要应用于生命科学领域。作为生物、化学、流体、材料、机械等学科交叉领域研究的技术平台，微流控芯片具备微型化、集成化、高通量等特点，并可自动化进行实时检测[2,3,4]，具有传统研究方法不可替代的优势。由于微流控芯片应用属于前沿交叉学科的新技术和新方法，目前在口腔医学领域还处于起步阶段。本文就微流控芯片在口腔医学领域中的研究进展做一综述，随着技术的发展，未来其在口腔领域有广阔的应用前景。
1 微流控芯片在牙源性细胞研究中的作用
微流控芯片能够精确控制细胞所处的微环境[5]，对于研究细胞对环境的应答至关重要。在牙源性细胞研究中，微流控芯片主要用来实时监测细胞迁移、构建细胞共培养系统、模拟口腔组织结构等。通过对细胞所处环境施加物理、化学等刺激因素，研究牙源性细胞的生理病理活动。
1.1 实时监测细胞迁移
微流控芯片能够可视化地实时监测细胞迁移。传统细胞迁移研究方法有划痕实验[6]、Boyden小室/Transwell小室[7]等，发展时间较长，但存在包括创口重现性低、难以实时观察、试剂消耗多、灵敏度低、大多在单因素条件下检测细胞迁移、对体内细胞迁移情况模拟程度低等不足。而微流控芯片的发展克服了传统细胞迁移研究方法的不足，能够同时控制多种因素以更真实模拟细胞的刺激因素，并进行实时检测。
细胞在一定浓度或浓度梯度化学物质的作用下进行迁移，微流控芯片可用于研究其迁移规律。Zengel等[8]设计出一体化的微室系统，在一个芯片上集成3个相同的单元，可同时完成3组实验。每个单元由2个储液池组成，各含有进样口，储液池由观察区域所连接，观察区域两侧有通道以通入细胞悬液。相较于Boyden小室实验，该芯片可形成稳定的浓度梯度并维持更长时间，能够可视化地追踪细胞的位置和轨迹，区分细胞的随意迁移与定向趋化。目前在牙源性细胞研究中多施加化学因素于微流控芯片进行研究。有学者用该微流系统研究牙髓干细胞、牙髓成纤维细胞在补体浓度梯度下的迁移情况，研究在补体C5a、C3a浓度梯度作用下细胞的定向迁移，结合其他实验，证明牙髓损伤后补体在募集过程中的作用[9,10]。Ruangsawasdi等[11]在进行牙髓再生研究的体外实验中，使用该装置研究不同浓度梯度下干细胞因子对人间充质干细胞的迁移作用，结果表明，干细胞因子形成的浓度梯度能够有效促进人间充质干细胞的迁移。
微流控芯片还可通过不同的设计施加多因素的刺激。在真实的细胞微环境中，各种物理、化学因素均会对细胞迁移产生影响，单因素的研究有时并不能满足实验需求。微流控芯片可在微米级的通道结构中精确控制多种细胞生长微环境要素，如化学浓度及浓度梯度、氧气浓度、电场刺激、基质成分等，可视化细胞迁移轨迹。因此，在牙源性细胞研究中，可根据实验需要在微流控芯片上施加不同的因素，依据细胞迁移表现的变化来探索不同因素对细胞的作用、细胞迁移的规律、细胞迁移信号机制及针对疾病寻找治疗靶点等[12,13,14]。
1.2构建细胞共培养系统
微流控芯片本身设计丰富，除了将不同物理、化学因素组合，还可通过集成微元件培养不同组织、细胞，构建细胞共培养系统，研究细胞间的相互作用。
关于牙齿发育的研究，Kang等[15]设计了一种间接共培养的微流体装置，具有试剂消耗量少、高通量、分析速度快的特点;在实验中，将脱落乳牙干细胞与牙龈成纤维细胞或牙周韧带干细胞共培养，在微流控系统构建的浓度梯度下，脱落乳牙干细胞在共培养系统中矿化效率无显着变化。然而，相较于与牙周韧带干细胞共培养，脱落乳牙干细胞与牙龈成纤维细胞共培养时其成骨细胞基因表达水平降低，表明其抑制成骨作用。该微流控培养装置能够建立共培养系统，并研究细胞间相互作用，并可通过实验设计进一步研究其作用机制等。
微流控芯片系统可用来研究颌面部组织器官的发育和神经元的行为[16,17,18,19]。Pagella等[18]最初使用微流控系统共培养鼠三叉神经节和发育中的牙齿以评估微流控系统的有效性，结果表明，在微流体装置中鼠三叉神经节和牙齿可以长时间存活，且能够保持与在体内环境下类似的相互吸引或排斥的作用，证明了微流控芯片系统能够作为一个有效的工具模拟体内微环境进行研究。随后，使用微流控芯片共培养系统来比较牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞对三叉神经和背根神经节神经元的神经营养作用，结果发现，共培养系统中与牙髓干细胞共培养的神经元轴突更长，牙髓干细胞能够诱导形成广泛的轴突网络并与神经元建立密切联系[16]。结合其他实验表明，牙髓干细胞能够支持和促进广泛的三叉神经支配，是修复受损颅面组织功能的较好选择。有研究使用微流控芯片探寻成釉细胞瘤转移与神经支配的联系，观察到成釉细胞瘤细胞与神经形成连接，提示成釉细胞瘤的神经支配可能在这种恶性肿瘤的发病中起关键作用，可能是非侵入性药物干预的一个靶点[17]。此外，微流控芯片可用来研究神经营养因子、合成类似物以及治疗药物在对颅面复合体中三叉神经及其靶点之间联系的相互作用[16]。
微流控芯片具有微型化、可视化等特点，其在研究细胞之间、细胞与组织之间等相互联系中具有不可替代的优势。
1.3 模拟口腔组织结构
随着微流控芯片技术的发展，设计复杂程度的提高，通过明晰细胞生存的微环境参数，在微流控芯片的设计中将各个因素以更贴近生理环境的方式组合起来模拟体内的微环境，能够得到更有效的数据来指导基础研究向临床的转化[20]。微流控芯片可通过不同的设计来模拟牙本质结构、牙髓血流、口腔黏膜等。
Fran?a等[21]设计了一种微流控芯片系统来模拟牙本质-牙髓界面，使用聚二甲基硅氧烷构建2个培养室，中间用牙本质片隔开，一侧培养牙髓细胞，另一侧设置不同的牙科材料，以研究生物材料对牙髓细胞的形态、代谢和功能影响。该系统构建了模拟牙髓-牙本质界面近生理状态的新平台，并可进行活细胞成像研究牙髓细胞对生物材料的反应。此外，Kim等[22]利用微流体建立了一个模拟牙髓内小动脉血流的模型，通过控制流体流速及其他参数模拟牙髓血流。近年来，多普勒超声被用来测定牙髓血流，使用该微流控芯片可对多普勒超声检测血流的准确性进行校正，同时为牙髓血流的相关研究提供研究平台。
Rahimi等[23]开发了一种微流控口腔黏膜模型，在具有连通孔隙的三通道微流控室的中央通道中组装了一种负载牙龈纤维母细胞的胶原水凝胶，然后在孔隙中暴露的胶原蛋白上附着一层角质细胞，这种组织样结构可稳定超过1周。该模型分别暴露于牙科材料、口腔细菌，产生不同的变化，可作为研究口腔黏膜与生物材料相互作用的平台。
2 微流控芯片在口腔微生物研究中的作用
在口腔微生物研究中，微流控芯片可通过构建微生物生存微环境，模拟组织结构进行微生物致病作用、药物抗菌效果及细菌生物膜特性研究。
2.1观察细菌侵袭及药物抗菌现象
微流控芯片制作精度高，具有微米级的尺寸，能够较好地模拟组织微细结构，并且具有高通量、可平行对比、便于观察的优点。因此，通过合理的设计，微流控芯片可用来模拟牙齿中的相关结构。
孙晓强等[24]设计基于牙本质小管大小与结构的微流控芯片，观察粪肠球菌在其中的生长情况及在营养缺乏和碱性环境等压力环境下侵入微管的能力，实验结果表明，在压力环境下，粪肠球菌对微管系统的侵入深度和数量显着下降。随后该课题组进一步研究微管的直径和长度对粪肠球菌的定植、侵入深度和速度的影响，并观察次氯酸钠对细菌的溶解情况，以研究药物的抗菌作用，对临床有一定的指导意义;同时表明微流控芯片能够有效模拟牙本质小管的结构，适于观察细菌在微小空间内的生长，可作为相关研究的标准化平台[25,26]。
2.2 定量研究细菌生物膜特性
微流控芯片系统广泛用于细菌生物膜的研究[27]。Nance等[28]开发一种高通量微流体系统，与共聚焦激光扫描显微镜相结合，定量评估抗菌药物CPC对人唾液中生长的口腔多物种生物膜的有效性。Kristensen等[29]报道了一种剪切力可调的微流控装置，通过调节流体的流速，模拟口腔内唾液的流动情况以研究唾液流速对细菌生物膜p H的影响。Gashti等[30]设计一种带有荧光纳米颗粒传感器的微流控平台，可用于实时监测生物膜的p H并成像;使用该装置监测唾液链球菌生物膜附着表面的p H变化，通过控制微通道中的流量和化学浓度条件，研究生物膜牙齿界面局部酸化等单因素对龋齿的影响。Lam等[31]报道了一种高通量的微流控“人造牙”装置，其可以控制包括营养物质、生长因子、气体环境和细胞群落等在内的多种微环境因素，用于长时间定量研究口腔细菌的生长以及生物膜变化;评估生物膜形态、定植密度和细菌物种的空间排列，如牙齿生物膜的成熟过程等。
设计精细的微流控装置精确模拟各种物理化学条件，可加深对生物膜微环境的认识，并且可通过使用小分子抑制剂、表面化学修饰破坏生物膜等方式研究生物膜形成的机制。
3 微流控芯片在口腔疾病早期诊断中的应用
早期发现口腔癌前病变和癌症对于提高患者的生存质量及延长寿命非常重要。微流控芯片系统目前已用来进行口腔癌筛查和诊断[32,33]。
使用微流控芯片对口腔癌患者唾液样本进行检测，膜相关蛋白作为病理研究基础，与正常人相关指标及数据库中癌症基因表型比对以进行诊断，成为一种快速、自动化的癌细胞分子分析方法[34]。Mauk等[35]设计了一种用于口腔鳞状细胞癌即时筛查的微流控芯片，通过对唾液样本中分离出的癌细胞进行约30个基因转录谱的测定进行诊断。Jokerst等[36]将半导体纳米粒子量子点集成到模块化微流体生物传感器中，实现了对3种重要癌症标记物(癌胚抗原、癌抗原125和Her-2/Neu)的多路定量。综合样品处理、分析物捕获和检测模式的功能在血清和唾液标本中都得到了验证。
完整的诊断芯片通常将细胞分选、细胞裂解、核酸提取、扩增和检测等微流控元件结合起来[35]。除了进行实时筛查，微流控芯片可监控疾病的进展、疗效，手术中通过检测确认肿瘤切除是否完整，辅助评估原发肿瘤是否播散到淋巴结。此外，结合其他检测系统，微流控芯片还可用来研究基因变异、染色体易位及其他与口腔癌发生发展相关的分子生物学改变[37]。
4 展望
微流控芯片丰富的设计方式和多样的用途得益于生物、化学、流体、材料、机械的发展，在生命科学领域已经广泛应用。而在口腔医学领域，微流控芯片目前在牙源性细胞研究、口腔微生物研究、口腔疾病早期诊断等方面有一定的应用。微流控芯片作为一种技术平台，在细胞迁移、构建细胞共培养系统、模拟口腔组织结构、微生物致病作用、药物抗菌效果及细菌生物膜特性等方面尚处于初步应用的阶段。
微流控芯片种类多样，通过改变芯片结构、集成功能组件、优化设计以满足研究需求是芯片工程师一直努力的方向[38]。在工程学领域期刊中为生物研究设计的微流控芯片不断推陈出新。由于口腔微环境、组织结构等有其自身特性，微流控芯片的使用需结合研究特点进行设计。因此，对于口腔医学领域科研工作者来说，结合研究需求选择合适的芯片，充分利用新技术平台的优势，是未来值得考虑的方向。
参考文献
[1] Manz A, Graber N,Widmer HM. Miniaturized total chemical analysis systems:A novel concept for chemical sensing[J]. Sens Actuators B Chem,1990,1(6):244-248.
[2] Melin J,Quake SR. Microfluidic large-scale integration the evolution of design rules for biologic al automation[J]. Annu Rev Biophys Biomol Struct,2007,36:213-231.
《微流控芯片在口腔医学领域的应用研究进展》来源：《中国实用口腔科杂志》，作者：张荷旋 侯本祥
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